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      RNAscope常見問題小貼士-樣本制備篇

      2021/9/8 15:06:27??????點擊:

      美國Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技術作為新一代的RNA原位雜交技術,通過其專利的雙Z探針設計原理以及信號級聯放大系統,可以兼容由于空氣中RNA酶對于RNA的部分降解導致一定程度的組織RNA缺損,從而達到對組織和細胞內的RNA進行高效的原位檢測。

      在使用RNAscope,Basescope以及miRNAscope對石蠟樣本,新鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進行原位雜交的過程中,經常會遇到各種各樣的技術問題。本專題就一系列典型代表性的問題進行歸類總結。本篇聚焦樣本制備步驟,給大家提供一些相關小貼士。

      對于RNAscope類實驗的樣本制備,說明書里有比較詳細的說明。需要注意的事項有以下一些:

      石蠟樣本的制備中,在冰上取材后建議第一時間放入10%中性福爾馬林固定液(10%NBF)浸泡16-32小時。固定液的體積建議至少是組織體積的10-20倍。充分固定組織樣本是RNA原位檢測的成敗關鍵之一。經過充分固定的組織樣本內的RNA可以與蛋白進行交聯。從而達到最佳的保護效果。

      對于新鮮冰凍樣本制備,需要提前準備好冰凍包埋模具(如下圖)以及倒入模具備用的OCT,以及盛有干冰的盒子或者-80℃冰箱。在組織取材時,在冰上將組織剝離后,切成適當大小后浸入預先倒入OCT的包埋模具中,之后快速將含有組織塊和OCT包埋模具放入裝有干冰的封閉盒子內或者直接放入-80℃冰箱。每個包埋模具浸入組織后第一時間放入干冰或者-80℃內進行冷凍保存。不建議積攢一批后再進行后續操作。組織樣本要在干冰或者-80℃冰箱內至少過夜保存后再進行切片處理。

      對于灌注固定的樣本,建議客戶使用新鮮配制的4%多聚甲醛(4%PFA)對動物進行灌注固定。組織取材后繼續放入新鮮的4%多聚甲醛(4% PFA)在4℃進行固定24小時。之后依次浸入15%和30%的蔗糖溶液中(4℃)至樣本沉入底部(依據樣本大小不同時間不同)。此步可以保護組織細胞形態。之后將組織塊浸入裝有OCT的組織包埋盒內,放入-80℃冰箱至少過夜后在進行切片制備。此步有一個關鍵點即4%多聚甲醛的有效性問題。由于多聚甲醛屬于強還原性試劑,故不像10%中性福爾馬林固定液那樣可以在室溫長期保存。4%PFA會隨著時間發生氧化,從而固定效果大打折扣。為了最大程度的維持4%PFA的固定效果,建議使用新鮮配制(當天配置)的4%PFA進行固定。如果當日不方便配置,可以事先配置好4%PFA,分裝并直接凍在-20℃,使用前拿出一只融化后立即使用。

      一般依據以上提示制備的組織石蠟塊或者冰凍組織塊,進行后續常規切片并相應的RNAscope, Basescope或者miRNAscope檢測,組織樣本可以通過質控(QC)檢測,即陽性對照探針檢測評分≧2,陰性對照為0。值得注意的是,石蠟塊相較于冰凍組織塊,可以更為長期的保存。經驗證經過上述標準化固定5-10年的石蠟塊在進行了石蠟切片后仍然可以通過RNAscope質控檢測,并進行靶探針檢測。值得注意的事,石蠟切片一旦切出來后,需要在2個月內完成實驗。

      除了常規組織樣本外,有研究團隊使用到1)微小組織樣本,例如類器官,3D培養細胞團或者小型昆蟲等樣本;2)骨骼組織或軟骨樣本;3)血液樣本進行RNAscope檢測,這幾類樣本同樣可以制備成石蠟塊,并進行RNAscope檢測。針對于這類樣本的石蠟塊制備流程,本公眾號之前的有相關樣本制備的軟文參考。骨骼樣本固定, 脫鈣及制備方法請參見題目為:RNA原位檢測中,骨和軟骨樣本制備處理技術淺談及應用;微小樣本制備請參見1)題目為:RNAscope技術在類器官中的應用舉例以及類器官石蠟樣本制備簡介;以及2)題目為:在談RNAscope技術與類器官的相關文章。更多類型樣本制備,例如血液樣本制備等問題可直接與我公司FAS團隊或者通過本公眾號聯系詢問。

      RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發的RNA原位雜交產品,在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比,RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術,其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端,配以自身級聯放大檢測原理,可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優勢如下:

      應用廣泛 

      使用RNAscope技術,靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列,即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種,所有組織以及所有基因的檢測。

      特異性強

      RNAscope獨特的雙Z(ZZ) 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合,同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點,并會在雜交過程中被洗脫掉,從而防止非特異性信號的放大,使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。

      靈敏度高

      RNAscope方法檢測每個RNA 分子時,只需三對雙Z(ZZ)探針即可完成雜交和信號的可視化。

      單分子可視化和單細胞定量

      使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。

      兼容降解的RNA

      由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA,而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針,因而即使目標RNA發生部分降解,仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。

      檢測結果穩定一致性

      RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成,且該技術針對不同樣本類型(冰凍切片, 石蠟切片,懸浮細胞,貼壁細胞等)已經有成熟的實驗操作流程,故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外,該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行,為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。

      多通道多靶點同時檢測

      由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大,故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點;而在熒光檢測過程中,可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。

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