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      限制性內切酶實驗問題指南

      2020/3/23 13:08:13??????點擊:

      1.限制性內切酶實驗問題指南


       

       

      2.高保真限制性內切酶常見問題解答

      Q. 為什么 HF 內切酶推薦使用的緩沖液與野生型的內切酶不同?

      A. 在許多情況下,突變導致高保真內切酶的最適緩沖液發生變化。比如,野生型 SalI 酶的最適緩沖液 NEBuffer 3.1 是高離子強度緩沖液,然而 SalI-HF? 的最適緩沖液為中等離子強度的 NEBuffer 2.1 CutSmart

      Q. 使用 CutSmart 緩沖液有什么優勢嗎?

      A. 是的,超過 200 種限制性內切酶(包括高保真限制性內切酶)在 CutSmart 緩沖液中有活性。當建立雙酶切
      反應時有很大優勢。 

       

      3.轉化反應問題解決指南                

      下面的指南可用于解決轉化過程中所出現的問題。

       

      無菌落或液體培養基中無細菌生長
      ? 即使 T7 表達為嚴格調控型,但是 T7 表達宿主菌中也可能存在低水平的基礎表達。如果表達的蛋白可能有毒
        性,表達質粒的轉化應使用下列系統:
      ? Iq 菌株中過量表達的 LacIq 抑制物能夠降低 T7 RNA 聚合酶的基礎表達。
      ? 在 lysY 菌株中,突變的 T7 溶解酶與 T7RNA 聚合酶相結合,從而減少目的蛋白的基礎表達。誘導后,新合
        成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作用,目的蛋白得到表達。
      ? 30℃ 或室溫培養也可減輕毒性問題。
      ? 檢查抗生素濃度(用對照質粒檢測)。、

       

      電泳無蛋白或無蛋白活性
      ? 檢查毒性—細胞可能刪除或缺失了表達質粒的元件。如果有毒性表達問題,試用Iq和/或 lysY 宿主以減少基礎
        表達。
      ? 培養用于誘導蛋白表達的細胞。誘導前,將樣品平行涂布于有抗生素和無抗生素選擇標記的平板。如果有毒性
        產生,則兩個平板菌落數會有顯著的不同。在含抗生素的平板上,菌落生長數量極少(表明質粒丟失了)。

       

      誘導蛋白不可溶

      T7 表達蛋白經常產量非常高,導致目的蛋白不可溶,解決方案如下:
      ? 低溫誘導(低溫 12-15℃ 過夜)
      ? 降低 IPTG 濃度至 0.01 mM-0.1 mM
      ? 縮短誘導時間(可以縮短至 15 分鐘)
      ? 細胞生長早期開始誘導(OD600 = 0.3 或 0.4)

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