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          沒有病毒抗體,也可以對武漢新型病毒 2019-nCoV 開展體內原位研究

          2020/3/25 10:42:24??????點擊:

          隨著 2019-nCoV 冠狀病毒疫情的日益嚴峻,人們對這一新型冠狀病毒也在進一步了解中,目前已經確認 2019-nCoV 病毒的序列,也了解到該病毒與 SARS 病毒感染機制相同,都是通過人細胞的 ACE2 蛋白結合,從而引發感染。


          而這一病毒進入細胞內之后的一些列生物學反應,對人體其他組織器官的易感性,乃至治療方法的選擇都有待進一步研究。


          作為新一代 RNA 原位雜交技術,美國 Bio-Techne 旗下 ACD 公司的 RNAscope 技術的一個巨大優勢就是可以在沒有可用抗體或者高效抗體的前題下,對靶標進行 RNA 水平的原位檢測,包括定位和定量研究。目前 ACD 公司已經針對此次 2019-nCoV 病毒的序列設計出探針,配合使用 ACD 公司的預處理和檢測試劑盒,可以對于該病毒進行體內原位檢測。


          不僅于此,由于 RNAscope 探針設計的可選擇性,除了目前已經設計出的探針外,客戶也可以根據自己需要,指定感興趣的病毒序列區域要求探針設計,以滿足不同的研發需要。


          事實上,RNAscope 技術作為病毒生物學研究的利器,在過去的若干年內一直被病毒研究界廣泛使用。該技術在 DNA 病毒,RNA 病毒以及逆轉錄病毒的諸多病毒研究領域均貢獻了大量原位信息。尤其可以提供病毒在不同組織器官中的具體 1)細胞類型的定位,2)疫苗效果的評估,3)動物模型建立后的驗證,4)感染機體的免疫反應等。



          在病毒定位研究中,2015 年巴西寨卡病毒(Zika)爆發時,華盛頓醫科大學 Jonathan J. Miner 為首的研究團隊即通過 RNAscope 方法檢測到寨卡病毒在視網膜,視神經和角膜中的分布,直觀給出了該病毒在眼內的分布圖(見下圖,病毒陽性信號為圖中的棕色信號點)[1]


          在對寨卡(Zika)病毒疫苗的研究中,美國 Vanderbilt University 的 Gopal 研究團隊發現人的單克隆抗體 ZIKV-117 可以有效減低小鼠感染 Zika 后組織的病理特點,并通過 RNAscope 檢測試劑盒檢測了注射安慰劑,同型對照小鼠抗體以及 ZIKV-117 抗體的懷孕小鼠胎盤內病毒的分布和數量,從而證實了疫苗的效果(見下圖,病毒為圖中的棕色信號點)[2]



          中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)是又一種近年來高致病性的冠狀病毒。在對該病毒疫苗的研發過程中,Haaqmans BL 研究團隊通過 RNAscope 技術檢測了注射疫苗的效果,發現駱駝鼻粘膜內,病毒顆粒在疫苗注射組相較于對照組有顯著下調(見下圖,RNAscope 陽性信號為 A 圖,B 圖和 C 圖中 ISH 中的紅色信號點[3]



          在病毒感染動物模型的建立和驗證中,Drexler JF 團隊通過 RNAscope 的方法,檢測小鼠肝細胞內 HCV 病毒的存在和分布狀況,確認 HCV 病毒感染動物模型建立成功(下圖中的紅色信號點[4]


          相同的 RNAscope 應用實例也被報道在漢他病毒(Sin Nombre/Hantavirus,SNV)感染病毒動物模型中。RNAscope 結果確認漢塔病毒存在于恒河猴肺臟上皮細胞內(下圖中棕色信號點)[5]


          在病毒入侵感染動物或人之后,免疫系統對于病毒的應激反應隨著病毒的差異而不同。例如在塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus,SVV)感染恒河猴體內,人們發現該病毒誘導短暫的 CD8 陽性 T 細胞在恒河猴的神經節浸潤。


          RNAscope 檢測結果顯示感染過 SVV 之后,伴隨著 CD8 陽性 T 細胞的聚集,同一區域表達 CXCL10 細胞趨化因子,提示 T 細胞的聚集是由 CXCL10 因子誘導引發的[4]


          如下圖所示,RNAscope ISH 對應的紅色信號點為 CXCL10 的 mRNA 信號。在這里,由于趨化因子本身為分泌型蛋白,免疫組化的方法很難進行組織學定位,而 RNAscope 方法可以很好地解決這個問題[6]


          RNAscope 技術


          RNAscope 技術是由 Bio-Techne 旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研發的 RNA 原位雜交產品,在近年來的生物檢測領域發展迅速。


          與傳統的 RNA 原位雜交相比,RNAscope 技術屬于新一代 RNA 原位雜交技術,其特異性的雙 Z 探針設計避免了傳統長鏈 RNA 探針的弊端,配以自身級聯放大檢測原理,可以高效敏感地檢測到目標 RNA。


          該方法的具體優勢如下:

          1. 應用廣泛: 使用 RNAscope 技術,靶點 RNA 為大于等于 300 個堿基的特異序列,即可進行探針設計。因而 RNAscope 技術可以應用于幾乎所有物種,所有組織以及所有基因的檢測。

          2. 特異性強:RNAscope 獨特的雙 Z(ZZ)探針設計有效的防止了探針的非特異性結合,同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的 Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點,并會在雜交過程中被洗脫掉,從而防止非特異性信號的放大,使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要 2~4 周時間即可完成。

          3. 靈敏度高:RNAscope 方法檢測每個 RNA 分子時,只需三對雙 Z(ZZ)探針即可完成雜交和信號的可視化。

          4. 單分子可視化和單細胞定量: 使用 RNAscope 技術雜交上三對及以上雙 Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD 公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內 RNA 的表達水平。

          5. 兼容降解的 RNA: 由于 RNAscope 三對雙 Z 探針即可檢測到目標 RNA,而通常針對靶點 RNA 設計的探針為 20 對雙 Z 探針,因而即使目標 RNA 發生部分降解,仍可以穩定有效地檢測到靶點 RNA。

          6. 檢測結果穩定一致性:RNAscope 技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成,且該技術針對不同樣本類型(冰凍切片, 石蠟切片,懸浮細胞,貼壁細胞等)已經有成熟的實驗操作流程,故使得 RNAscope 技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外,該產品也可以在 Leica 以及羅氏 Ventana 自動平臺上運行,為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。

          7. 多通道多靶點同時檢測:由于 RNAscope 技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大,故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點;而在熒光檢測過程中,可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點 RNA。



          References:

          1. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell Rep 2016, 16(12):3208-3218;

          2. Neutralizing human antibodies prevent Zika virus replication and fetal disease in mice. Nature 2016, 540(7633):443-447;

          3. An orthopoxvirus-based vaccine reduces virus excretion after MERS-CoV infection in dromedary camels. Science 2016, 35(6268):77-81;

          4. Evidence for novel hepaciviruses in rodents. PLoS Pathog 2013, 9(6): e100343;

          5. Pathophysiology of hantavirus pulmonary syndrome in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A 2014, 111(19);

          6. T-cell infiltration correlates with CXCL10 expression in ganglia of cynomolgus macaques with reactivated simian varicella virus. J Virol 2013, 87(5):2979-2982.

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